В нашей базе: 139952 рефератов
Последние добавления Тор 100
Поиск искать просто Реферат        Расширеный поиск Точный поиск
Вхід в абонемент


Методы клеточной биологии

1. Микроскопия.

2. Радиоизотопный и неизотопных методы мечения.

3. Определение физиологического состояния клетки.

4. Клеточная инженерия.

1

Микроскопия - совокупность методов наблюдения микрообъектов с по-мощью различных микроскопов.

Сейчас очень широко используются следующие виды микроскопов как фазово-кон-трастний, флуоресцентный, а в частности конфокальный сканирующий микроскоп, электронный трансмиссионный и сканирующий микроскопы, а в последнее время атомный силовой микроскоп.

Все, что сейчас известно о клетке и ее органеллы, было установлено по-мощью электронной и световой микроскопии (включая темнопольном, фазово-контрастную и флуоресцентную). Так, в частности, было установлено наличие плазмы-Малем, тонкое строение хлоропластов и митохондрий, центриолей, аппарата Голь-джи т.п.. Фактически развитие клеточной биологии, как и многих других биологических ных дисциплин определяется появлением новых методов исследования. Так, с появлением светового микроскопа были открыты самые клетки, трансмиссионный электронный микроскоп позволил установить микроструктуру органелл. Сейчас локализация компонент клетки (в частности белков, ионов неорганических соединений) определяется с помощью флуоресцентного микроскопа, соединенного с компьютером и цифро-вой камерой. Соединение с компьютером позволяет работать с отдельными эле-ментами изображения с помощью специальных программ. Как флуоресцентную метку используют различные красители - флуоресцеин, родамин, DAPI т.п.. Ши-роко используется так называемый зеленый флуоресцентный белок (GFP), который выделяют из медузы Aequorea victoria. Как правило, в клетку вводят генный конструкт (плазмиду), в которой ген, ответственный за кодирование исследуемого белка, слитый с геном, который кодирует GFP. Конструкт интегрируется в хромосому. Исследуемый белок коекспресуеться с GFP, представляя собой химерний миче-ный белок. Флуоресценция, обусловленная GFP позволяет следить за перемещен-нием и локализацией исследуемого белка. Наиболее распространенными бар-вник является дихлорофлуоресцеин диацетат (DCFDA), который взаимодействует с пероксы-дом водорода; изотиоцианат флуоресцеина, родамин, сафранина О, Хьохст (Hoechst) и DAPI (4, 6-диамидино-2-фенилиндол), акридинового оранжевого, бромиды и йодиды этидия и пропидию. Для визуализации F-актинового цитоскелета используемой-ся фалоидин, связанный с флуоресцентной меткой. С помощью мито-и ER-трекеров вточнено форму эндоплазматического ретикулума и митохондрий. Со-крема установлено, что митохондрии не редкость двомембраннимы вези-кулами, разбросанными по клетке, а образуют сеть, которая, подобно эндо-плазматической сети, состоит из длинных каналов и "цистерн", находящихся в постоянном движении. Митохондриальные канальцы могут разрываться и сливаться между собой в точках соприкосновения, причем этот процесс не спонтанный, однако кон-ся специальными белками - митофузинамы.

Одним из достижений современной световой микроскопии является оптика Номарского или дифференциально-интерференционный контраст. Последний достигается с помо-щью использования растров. Оптику Номарского часто используют для ми-кроманипуляций с клетками.

Электронный микроскоп - прибор, в котором для получения увеличенного со-жения используется струя электронов. Электронных микроскопов ис-ет два основных типа: трансмиссионный и сканирующий. Трансмиссионный микро-скоп пропускает пучок электронов через препарат (ультратонкий срез), форму-кая изображения на экране с ним. В сканирующих микроскопе пучок электро-нов проходит над препаратом точка за точкой, вызывая эмиссию вторичного пучка образует изображение на флуоресцентном экране катодной лучевой вой трубки; различия глубины поверхности могут образовывать трехмерное со-жения.

середине 80-х гг 20 века был развит метод атомной силовой ми-кроскопии. Апогей приходится на конец 90-х, когда Бану Йена и сотруд-никами было установлено наличие и структура Поросенок в плазмалемме, с по-мощью которых осуществляется секреция гранул зимогена в клетках поджелудочной железы. Одним из основных элементов атомного силового микроскопа является чрезвычайно конечно тонкая игла, привлекаемого атомами поверхности объекта. Движение иглы, обусловленный неровностями поверхности, трансформируется в электрические сигналы, а остальные - с помощью компьютера - в изображение.

Существует множество других разновидностей микроскопии, в частности световой. Различия касаются строения оптической системы и направлены на достижении максимальной четкости изображения. Однако контрастность не является самостоятельной целью. Выбор мы-кроскопу определяется типом структур, желает рассматривать исследователь. Иногда бывает достаточно простого иммерсионной микроскопии, порой бывает уместной темнопольная микроскопия. Очень часто все эти возможности можно реализовать на одной платформе, используя различные насадки и вида освещения.

2

Авторадиография - метод регистрации распределения радиоактивных веществ в объекте. Пленка с чувствительной к радиоактивному излучению эмульсией на-кладаеться на срез. Радиоактивные вещества как бы сами себя фотографируют. Места потемнение на пленке после проявления соответствуют локализации радиоактивных частиц.

3

Современные исследования в области клеточной биологии ориентированы на наблюдения и экспериментах, которые позволяют установить роль органелл и отдельных молекулярных комплексов в физиологических процессах. Клетка, таким образом, раз-рассматривается в динамике. Особое внимание уделяется процессам некроза, апопто-зу (программируемой гибели клетки), дифференциации, перерождение. Исследуемой ются изменения в клетке и органеллах за действия различных факторов.

Для индикации некроза и апоптоза сейчас широко используется проточная цитофлуориметрии. При этом клетки окрашиваются прижизненным флуорохро-мом, способным связываться с ДНК, например Хьохстом или DAPI. Затем об-пензия крашеных клеток пропускается через ультравузький канал, в котором клетки следуют одна за другой. В определенном месте канала находится детектор, который улавливает флуоресценцию клетки. Здесь стоит отметить, что в зависимости от фазы клеточного цикла клетки содержат разное количество ДНК. Интенсивность флу-оресценции будет зависеть как от количества ДНК, так и от ее состояния (фрагментирована /дефрагментированы). Цитометр выводит данные на экран компьютера, обозначая каждую клетку в виде точки. Причем эти точки выводятся на плоскость ко-ординат. По оси ординат откладывается количество клеток, а по оси абсцисс - ин-вностью флуоресценции каждой клетки. Поэтому общий подсчет имеет вид фигуры с пиками. Размещение пиков (паттерн) зависит от фазы клеточного цикла и состояния ДНК. Впрочем, красить можно любую структуру клетки: нуж-но только знать, как выглядит пик для "нормы" и значение его смещения.

Для идентификации апоптоза /некроза часто используется имуногистохи-ческий анализ с последующей микроскопией, флуоресцентная микроскопия, иммуно-ферментный анализ и т.д.. Флуоресцентную микроскопию применяют при покраски ДНК (АО /ЕВ-тест), определении рН клетки и митохондрий (красители JC-1и JC-9). Биохимические методы связаны с определением активностей ферментов (каспазы, dUTP-дезоксинуклеотидилтрансферази), установлением фрагментации ДНК путем электрофореза в агарозном геле, окраской одноцепочечной ДНК и т.п.. "Комет"-тест основан на электрофорезе целых клеток в полиакры-ламидному гели. Апоптотические клетки оставляют за собой "хвост", напоминая комету.

Для исследования ионных каналов нервных клеток Б. Закман и Е. Неер раз-делали технику "Пэтч-Кламп". Пэтч-Кламп - тип зажима, при котором клемма электрода зажата напротив участка мембраны клеток. Таким образом форму-ется электрически герметичное уплотнение для измерения тока, прохо-дить через единичные ионные каналы.

4

Клеточная инженерия - создание клеток нового типа на основе их гибрида-дизации, реконструкции и культивирования. В узком смысле - это гибридиза-ция протопластов или животных клеток, в широком - различные манипуляции с ними, направленные на решение научных и практических задач. С помощью этого метода созданы гибридомы, которые используются для получения моноклональ-ных антител.

В основе метода гибридизации соматических клеток лежит слияние клеток, в ре-зультате чего образуются гетерокарионы, содержащие ядра обоих родительских типов. В 1965-м году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерока-Риони, образованные клетками мыши и человека.

Первый межвидовой гибрид при слиянии протопластов различных видов табака был получен в 1972 году П. Карлсоном. Особенно интересны гибриды растений, несущих цитоплазматические гены устойчивости к различным патогенам и стрессовых фак-торов. Слияние протопластов используют также для получения гибридов с ценными свойствами между отдаленными видами, которые плохо или вообще не скрещиваются обычным путем. Например, удалось ресинтезировать рапс, являющийся естественным амфиплоидом между турнепсом и капустой, получить соматический ги-гибридов картофеля с томатами.